储存条件： PMSF -20℃避光保存， RIPA裂解液4℃保存， 

简介： 

     RIPA 裂解液是一种传统的细胞组织快速裂解液，裂解得到的蛋白样品可用于常规的 Western、IP 等实验。蛋白样品可用 BCA Protein Assay Kit (BN27109) 测定蛋白浓度。 由于含有较高浓度的去污剂，不能用 Bradford 法测定 RIPA 裂解后的蛋白浓度。RIPA 裂解液 种类很多，根据其裂解液的强度不同为强、中、弱三类。为保证实验结果请根据检测样本与检 测目的的不同选择适当的裂解液。 

    RIPA 裂解液(强)（Enhanced RIPA Lysis buffer）主要由 50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS 等组成，并含有多种蛋白酶 抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，维持原有的蛋白间相互作用。含有 PMSF(100mM, 100×)一支。 

本产品仅用于科研领域，不用于临床诊断。 

使用方法： 

(一) 贴壁培养细胞 

    1. 取 Enhanced RIPA Lysis Buffer 室温溶解混匀，加入 PMSF 使终浓度为 1mM。

    2. 去除贴壁细胞的培养液，用 PBS、NS 或无血清培养液清洗 1 次，低速离心，弃上 清，留取沉淀。 

    3. 按照 6 孔板每孔加入 150～250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 RIPA Lysis Buffer 。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或 4℃裂解 15～ 30min，通常裂解液作用于细胞 1～3 秒内，细胞就会被裂解。通常 6 孔板每孔细胞 加入 150μl 裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200～250μl。

    4. 10000～12000g，4℃离心 5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

    5. 进行后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二) 悬浮培养细胞 

    1. 取 Enhanced RIPA Lysis Buffer 室温溶解混匀，加入 PMSF 使终浓度为 1mM。

    2. 低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。 

    3. 用手指轻弹细胞，使其松散。按照 6 孔板每孔细胞加入 150～250μl 含有 PMSF 的 裂解液的比例，加入 Enhanced RIPA Lysis Buffer。通常 6 孔板每孔细胞加入 150μl 裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200～250μl。 再用手指轻弹以充分裂解细胞，充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

    4. 10000～12000g，4℃离心 5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

    5. 进行后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。有效期 12 个月。

(三) 组织样本 

    1. 取 Enhanced RIPA Lysis Buffer 置室温溶解混匀，加入 PMSF 使终浓度为 1mM。 

    2. 把组织剪切成细小的碎片，越小越好。 

    3. 取在液氮或超低温冰箱中冷冻 30min 以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量 控制在 1～2min 之内，以减少蛋白的降解。 

    4. 按照每 20mg 组织加入 150～250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的裂解液。冰上 或 4℃裂解 15～30min。 

    5. 步骤 3、4 亦可以采用如下过程：按照每 20mg 组织加入 150～250μl 裂解液的比 例，加入含有 PMSF 的 Enhanced RIPA Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器 匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在 1～2min 之内，以减少蛋白的降解。 

    6. 10000～12000g，4℃离心 5～10min (如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。 

    7. 进行后续的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。 

注意事项： 

    1. 去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。 

    2. 如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。 

    3. 如果细胞量较多，必需分装成 50～100 万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞 较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。 

    4. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈 Vortex 使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是 比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

    5. Medium RIPA Lysis Buffer 含有 Leagene 特殊成分，在低温情况下有可能出现浑浊 现象，可 37℃水浴促其溶解，不会影响使用效果；溶解时间不易过长，避免有效成分失效。 

    6. 裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因 组 DNA 等的复合物。在不检测和基因组 DNA 结合特别紧密的蛋白的情况下，可以 直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。 

    7. 细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或 4℃进行。

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