【包装规格】 48/96 测试 

【预期用途】 检测小鼠生物标本中 TNF-α/IFN-γ/IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1 的表达水平。

【检验原理】 

     本试剂盒采用 CBA 多因子流式检测技术，微球 荧 光 编 码 不 同 ， 不 同 微 球 群 上 包 被 mouse TNF- α /IFN- γ /IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1 特异性抗体，与待测样本孵育，可与样本中 mouse TNF-α/IFN-γ/IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1 特异性结合，之后加入生物素标记的检测抗体，形成抗体包被微球-细胞因子-检测抗体的免疫复合物；最后加入藻红蛋白 标记的链霉亲和素，与生物素结合，通过流式细胞仪检测，获得待测物的荧光强度，荧光强度与样本中 mouse TNF-α、 IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12、MCP-1 的含量成正比，最后结合这六种细胞因子标准品的标准曲线，从而实现对同一份样 本中 mouse TNF-α/IFN-γ/IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1 的定量检测。从而辅助判断机体的免疫功能状态。

【试剂盒组分】

注：试剂盒中不包括，但试验需要的材料：流式管，15 mL 离心管，1.5 mL EP 管，锡箔纸，磁力板。

【储存条件及有效期】

     2～8℃，避光保存，有效期 12 个月。开瓶后避光2～8℃保存，可保存不超过 30 天。

【适用机型】

     本品适用于 BD 公司的 BD FACSCanto II、Beckman Navios 6/2 和艾森公司的 ACEA NovoCyte 等有 PE、APC 通道的 流式细胞仪。 

【样本要求】

     血清：建议 4-6 小时内检测，如无法及时检测请-20℃冻存，忌反复冻融。

【检验方法】

     1 洗液（1×）的准备 颠倒混合标有 20×洗液的瓶子。在 475 mL 蒸馏水中加入 20×洗液 25 mL，并轻轻混合以免起泡沫。储存于 2～8℃待用。

     2 标准品制备（准备 8 个 1.5 mL EP 管分别编号 1.2.3.4.5.6.7.8） 

          2.1 取出标准品冻干粉，每个因子用 20 μL 标准品/样品稀释液溶解，充分混匀，室温放置 10 分钟，将溶解后的六个因 子转移至 1 号管，并补 80ul 标准品/样品稀释液，作为标准品最高浓度 5000 pg/mL。

          2.2 其他 7 个（2～8 号）EP 管中分别加入 150 μL 标准品/样品稀释液，准备梯度稀释标准品。 

          2.3 在 1 号管中转移 50 μL 标准品到 2 号管充分混匀，再在 2 号管转移 50 μL 到 3 号管充分混匀。以同样方式依次连续 稀释到 7 号管。

     3 捕获微球混合液处理 

          确定实验孔数（包括标准品和样本），计算所需捕获微球混合液的用量。例如：待测样本88个，标准品8个，共计96孔。 每个孔需要捕获微球混合液50 μL。我们可以按100孔的量进行微球混合，需取5000 μL捕获微球混合液。（注意：需将 捕获微球涡旋20 s，充分混匀后再取） 

     4 样本处理 

          建议对于血清或血浆样本需使用标准品/样品稀释液进行2倍稀释。

                                                                                                                            表1

     5 操作步骤

          *实验前将所有试剂取出平衡至室温；5 操作步骤

          *实验过程中，包括清洗步骤，将板子始终水平放置，以免珠子丢失； 

          *孵育过程中，板子应注意避光。

          5.1 从梯度稀释好的标准品 1-8 号管中分别取出 50 μL 移入对应的 96 孔板孔中。 

          5.2 其余样本孔每孔加入稀释好的血清或血浆样本 50 μL。

          5.3 涡旋微球 30 s，每孔加入 50 μL 微球，现每孔体积应为 100 μL/孔。（加微球过程中应随时涡旋微球管，避免微球 沉降，建议每加 8 个孔，涡旋混匀一次微球）。 

          5.4 将 96 孔板放到摇床上 450 rpm/min 摇 2min 后，放入 37℃温箱，避光孵育 30min。

          5.5 将 96 孔板卡在磁力板上 5 min，去除上清。

          5.6 将 96 孔板从磁力板上取下，每孔加入 200 μL 洗液。

          5.7 重复步骤 5.5。 

          5.8 将 96 孔板从磁力板上取下，每孔加入 100 μL 检测抗体。 

          5.9 将 96 孔板放到摇床上 450 rpm/min 摇 2min 后，放入 37℃温箱，避光孵育 30min。 

          5.10 重复步骤 5.5-5.7。 

          5.11 将 96 孔板从磁力板上取下，每孔加入 100 μL 藻红蛋白标记的链霉亲和素。 

          5.12 将 96 孔板放到摇床上 450 rpm/min 摇 2min 后，放入 37℃温箱，避光孵育 15min。 

          5.13 重复步骤 5.5-5.7。 

          5.14 每孔加入 200 μL 洗液重悬样本，上流式细胞仪检测。 

     6 流式细胞仪检测

          6.1 微球群分布：

注：微球内部用不同强度的荧光染料染色。

           6.2 模板建立： 

                建立X轴为FSC、Y轴为SSC的线性散点图模板，设定混合微球位置，如下图 1； 

                建议两个PE（X轴）和APC的对数散点图模板，分别显示R1门或R2门内微球，使得所有的微球群能够清楚和明显的分布于 散点图上，显示各因子PE荧光强度。如图2，图3。

       调节PE PMT电压，使所有微球群右侧不压线，左侧位于PE轴检测范围内（图2,3）。 

          6.3 样品的检测结果分析 

                各标准品及样本依次上机检测，对于每种微球群，应最少获取100个微球。利用标准品梯度作标曲，计算样本检测结果。

【检测结果的解释】

      1. 待检测样本细胞因子的测定在表 3 检测范围内，测定结果有效，可直接报告测定结果；若检测结果超出检测范围，应用 标准品/样品/微球稀释液将样本稀释适当的倍数重新检测；若待测样本的检测结果低于检测下限或未检测到，则直接报告为≤最 低检测值。

                                                                                                                      表3

     2. 建议：负责数据揭示和出具报告的实验人员需经过正规的技术培训。

【检验方法的局限性】 

     1. 不合理的样本采集、转运、储存、处理以及仪器的设置不当均有可能导致错误的检测结果。

【产品性能指标】

1. 外观和性状 

     试剂盒各组份应齐全、完整，液体无渗漏；外包装应完整、无破损，标签应清晰、易识别。 

2. 装量 

     应符合要求，不低于标示值。

3. 准确度 

     使用本试剂盒检测已知浓度的样本，其检测结果相对偏差在±15%以内。

4. 重复性 

     本试剂盒检测 TNF-α/IFN-γ/IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1 变异系数（CV）应≤15%。

【注意事项】

     1. 实验样本、质控/标准品、实验废弃物等材料应当作为潜在传染物进行处理，并且采用符合法规的预防措施对其处理。 

     2. 流式细胞仪未经正确校准、荧光渗漏未进行合理补偿以及检测区域（设门）未精确定位，则可能产生错误的检测结果。 请参考该仪器操作规程进行校准，确保仪器在使用前处于最佳检测状态。

     3. 本品含荧光素，切勿直接接触皮肤或沾染食物，操作时务必戴手套操作。

     4. 标准品在配成溶液后，请在10小时内使用。 

     5. 在使用之前，捕获微球混合液必须充分的振动混合。

     6. 为确保荧光检测质量，凡涉及检测抗体的相关步骤都需避光操作。 

     7. 不同批号的试剂请勿混用，并请在有效期范围内使用。