规 格：10T/20T  

运输与保存方法：

     冰袋运输。 

     组分 80101-1/80101-4, -20℃保存 

     组分 80101-2/80101-3/80101-5, 需 4℃保存

产品介绍： 

     百瑞极生物慢病毒包装试剂盒，对包装系统进行了优化，增加了我司特有的慢病毒出毒 增强培养基。相同的包装量，相比较实验室常规的包装体系能增加 3-10 倍的出毒量，让您 的病毒包装简单快捷，让初学者也能快速包装高滴度的慢病毒。

     试剂盒的组分包含包装质粒、转染试剂、转染增强剂、慢病毒出毒增强培养基等。适用 于基因过表达和干扰慢病毒的包装，以及后续稳定细胞株的构建。

     客户只需构建骨架质粒，和试剂盒中的包装质粒 Easy Mix 按 1：1 混合，用 LipoX  Transfection Reagent 将混合后的质粒转染 293T 细胞，8h 就能看到荧光，48h 就能收获高滴 度的慢病毒，利用慢病毒浓缩液或者超滤柱能快速浓缩纯化病毒，为后续的感染实验提供高 纯度高滴度的病毒。

产品组分：

质粒准备：

     慢病毒骨架质粒构建与大提：构建含目的基因或 shRNA 的骨架质粒，并进行大提获得 足够质量的无内毒素质粒，且所提质粒 DNA 的 A260/A280 在 1.8～2.0 之间，浓度大于 0.8 μg/μl。

     细胞状态：选择状态良好的 293T 细胞进行病毒包装，尽量选择低代数细胞。

实验流程：

     实验开始之前，在出毒增强培养基中加入 25ml 优质胎牛血清（5%血清），转染前一天 即开始使用此培养基，也可以用此培养基调整细胞状态。

1）293T 细胞准备：转染前一天，将已经状态良好的 293T 细胞以合适比例接种到 10cm 培 养皿中，当细胞长到 80%左右时准备转染； 

2）转染：转染前视细胞状态和密度决定是否提前换液。取两个无酶无菌的 1.5ml EP 管，在 A、B 管中先都加入 500μl Opti-MEM，然后再分别加入质粒和转染试剂，详细内容参考表：

     将 B 管转染试剂混合液加到 A 管中，轻轻混匀后，室温放置 15min~20min 后，再将 AB 管混合液加到细胞中摇匀然后加入转染增强剂 10ul(10ml 体积加 10ul)，置于 CO2 培养箱继 续培养；

3）换液：转染过夜后，小心弃掉细胞上清（注意收集上清后需要灭菌处理），然后加入 10ml 新鲜的培养基继续培养；

4）病毒收集：换液 36-48h 后，吸取细胞上清液于 50ml 离心管，4℃保存，再重新加入 10ml 新鲜的培养基，24h 后再收集一次细胞上清于第一次的离心管中；

5）病毒处理：4℃，4000rpm 离心 10min 收集上清液，并用 0.45μm 滤器过滤后转移到新的 离心管中。对病毒进行分装保存，可以直接用于下游实验。如果对病毒的滴度及纯度有较高 要求，可用本公司的慢病毒浓缩液（BN80102）对病毒原液进行浓缩与纯化。也可以使用超 滤管超滤实现病毒的浓缩；

6）病毒浓缩：使用本公司的慢病毒浓缩液（BN80102）进行病毒的浓缩，按病毒原液的 1/4 体积加入病毒浓缩液，混匀后 4℃过夜（每 20～30min 混合一次，共进行 3-5 次）。第二天，4℃，4000rpm，离心 20min，吸弃上清后静置管子 1～2 分钟，吸走残余液体，再加入适量 的 PBS 或培养基溶解慢病毒沉淀；超滤选择 100KD 大小的超滤管，4000-6000rpm，4℃离心。

7）病毒分装与保存：将病毒原液或浓缩液按合适体积进行分装，再保存于-80℃。

注意事项 

     1、构建稳定细胞株时，可用病毒感染增强剂和嘌呤霉素对细胞进行感染和筛选。 

     2、为了您的健康，实验操作过程尽量在生物安全柜中完成，并做好个人防护，请穿实验服 和带一次性手套。所有实验废弃物均需要进行灭菌处理。 

     3、小量病毒包装时，也可以使用小提质粒。转染时如无 opti-MEM，可以用 PBS、生理盐水 或无血清 DMEM 代替。 

     4、在慢病毒包装过程中使用 opti-MEM 培养基，将出毒增强剂按照比例（(10ml 体积加 300ul) 加入 opti-MEM 培养基培养细胞，会获得更好的出毒效果。