苯基-琼脂糖凝胶 6FF 是将苯基键合在琼脂糖凝胶 6FF 上形成的一种可利用疏水相互作用来实现目标 产品纯化分离的疏水类介质。

1 理化指标

                   *柱子：内径 10mm、柱长 20cm。柱床高 5cm，25℃，流动相为水。

2 贮存

     产品应密封贮存在 4℃~25℃（保存溶液为 20%乙醇），通风、干燥、清洁的地方，不能冷冻。 用过的柱子贮存在 4℃（20%乙醇）。

3 应用

     本产品具有高化学稳定性、高流速、高载量、好的机械性能、可在位清洗、多次重复使用等特点， 非特异性吸附低，回收率高，适用于工业规模生产，适用于在 pH 工作范围内可形成正离子的生物大分子的分离纯化，广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的离子交换制备。

3.1 装柱

     （1）让所有的材料和试剂均平衡至层析实验的温度。配制缓冲液，对所有的缓冲液进行脱气处理。 

     （2）检查层析柱所有部件，特别是过滤网，密封圈，螺旋塞是否紧密，玻璃管是否干净和完整。

     （3）根据需要量取相应量的凝胶，用去离子水清洗掉 20%乙醇。 

     （4）将柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位，务必使底端无气泡。 

     （5）用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。

     （6）打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的 1.33 倍的流速流过，使柱床稳定（注意压力不要超过填料最大耐压）

3.2 平衡

     上样前平衡层析柱至少 5-10 个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止（流出液的 pH 值和电导值等于 上柱的 Buffer 的 pH 值和电导值）。 

3.3 上样

     上样量的多少和多种因素相关，样品的性质和缓冲液的不同，上样量也不同。高配基密度不一定对 应高吸附蛋白量，但是高配基密度可以促进蛋白质的多点附着，否则蛋白质可能难以吸附，中等的配基 密度可以通过调节缓冲液的浓度来选择性结合目标蛋白。

     （1）样品应溶解在平衡缓冲液中，可以通过透析或脱盐的方法将样品的缓冲液进行置换。样品的粘 度不应超过缓冲液的粘度。样品一定要离心或过滤后上样； 

     （2）用于样品结合和洗脱的流速取决于所需的分辨率，通常流速越低，分辨率越好。

     （3）蛋白质与疏水性填料的结合受以下影响：

          配基的结构（例如，碳链或芳族配体）

          配基密度 

          缓冲液的离子强度

          盐析效应：引起盐析的盐（例如硫酸铵）也促进与疏水配基的结合。将样品溶解在高离子强度 的溶液中，典型的起始缓冲液是 1.7M 的（NH 4）2SO4，刚好低于用于盐析蛋白质的浓度。

          气温：疏水相互作用在较低温度下较弱。如果色谱在冷室中进行，则必须考虑这一点。

3.4 洗脱

     结合的蛋白可以通过降低疏水相互作用的强度而被洗脱，这可以通过以下方式完成： 

     （1）用盐梯度递减（线性或阶梯）来进行洗脱； 

     （2）用添加到缓冲液中的极性降低的有机溶剂（例如乙二醇）洗脱；

     （3）用加入到缓冲液中的去污剂洗脱。

常用的缓冲液如下：

     缓冲液 A：50mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.0 + 1.7M（NH4）2SO4

     缓冲液 B：50mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.0

3.5 再生

     用低离子强度缓冲液洗脱，监测再生期间的紫外吸光度，以确定结合物质何时完全从柱中洗出。用大量蒸馏水洗柱，用至少 5 倍柱体积的起始缓冲液重新平衡。 

     在一些应用中，诸如变性蛋白质或脂质的物质在再生过程中洗脱不掉。这些可以通过在位清洗程序除去。

3.6 在位清洗 

     （1）用 0.1M NaOH 溶液洗涤柱子，然后立即用大量蒸馏水清洗柱子，来除去沉淀的蛋白质。 

     （2）通过用 70％乙醇或 30％异丙醇来除去强的疏水性结合的蛋白质、脂蛋白和脂质。当使用高浓 度有机溶剂时，需要注意避免气泡形成，最后用蒸馏水洗涤柱子并重新平衡。

4 保存

     未使用的填料，4-25℃密闭保存，使用完的填料，用纯水彻底冲洗，最后保存在 20%乙醇中，4℃保 存。

5 注意事项 

     （1）上样之前，样品必须经过膜过滤及去除色素，否则杂质及色素会被吸附到填料上，影响填料的 正常使用。所有的缓冲液均需要用 0.45um 的过滤器过滤。

     （2）在使用过程中，避免使用高浓度的强酸强碱，酸和碱的浓度应低于 0.1 摩尔。碱会使流速变慢。

    （3）不同的样品，吸附和洗脱方法不相同，可以根据相关的文献进行。